مجله پژوهش در متابولیت‌های  گیاهی

مجله پژوهش در متابولیت‌های گیاهی

بررسی کارایی سویه‌های اگروباکتریوم (Agrobacterium rhizogenes) و انواع ریز نمونه‌ بر بازده تراریختی و ظرفیت آنتی اکسیدانی ریشه‌های مویین گیاه سنبل‌الطیب (Valeriana officinalis L.)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان
1 گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، ایران
2 گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران
3 گروه تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران
10.22034/jrpsm.2026.562414.1102
چکیده
سابقه و هدف: تولید ریشه‌های مویین از طریق آگروباکتریوم‌ریزوژنز، روشی مؤثر و پایدار برای تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی است. سنبل‌الطیب (Valeriana officinalis L.) با دارا بودن ترکیبات دارویی ارزشمند همچون والپوتریات‌ها و اسیدهای والرنیک، کاندیدای مناسبی برای مطالعات بیوتکنولوژی است. هدف از این پژوهش، بررسی تأثیر متقابل نوع ریزنمونه و سویه‌های مختلف آگروباکتریوم‌ رایزوژنز بر شاخص‌های رشدی و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی ریشه‌های مویین این گیاه بود.
مواد و روش‌ها: آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با دو فاکتور ریزنمونه (ریشه، ساقه و برگ) و سویه باکتری (MSU، A4، A13 وATCC) انجام شد. بذرهای استاندارد گیاه، در محیط MS کشت شدند. سویه‌های باکتری در محیط LB حاوی ریفامپیسین کشت داده شدند و سوسپانسیون نهایی با غلظت 10⁸×1CFU/ml سلول در میلی‌لیتر در محیط MS مایع تهیه شد. ریزنمونه‌های یکماهه به مدت ۳۰ دقیقه در سوسپانسیون باکتری حاوی ۱۰۰ میلی‌گرم در لیتر استوسیرینگون تلقیح شدند. پس از دوره هم‌کشتی ۴۸ ساعته بر روی محیط MS جامد، باکتری‌های اضافی با شستشو در محیط حاوی سفوتاکسیم حذف شدند. پارامترهای درصد القا، سرعت تشکیل ریشه، تعداد ریشه در هر ریزنمونه و وزن خشک ریشه‌های مویین اندازه‌گیری شدند. تراریختی ریشه‌ها با استخراج DNA و تکثیر ژن rolB به روش PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و برنامه دمایی استاندارد تأیید گردید. فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های متانولی ریشه‌ها با روش مهار رادیکال DPPH سنجیده شد. داده‌ها با نرم‌افزار SAS تجزیه و تحلیل و مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن انجام شد.
نتایج: نتایج نشان داد که اثر متقابل ریزنمونه و سویه بر تمامی صفات اندازه‌گیری‌شده معنی‌دار بود. بیشترین درصد القای ریشه مویین (٪99/3) در ترکیب ریزنمونه ریشه و سویه MSU حاصل شد و کمترین میزان (٪48/7) متعلق به ساقه تلقیح‌شده با سویه ATCC بود. سریع‌ترین ظهور ریشه‌های مویین (۵ روز پس از تلقیح) در ریزنمونه ریشه و سویه MSU مشاهده شد و کندترین القا (میانگین ۲۶ روز) به ساقه و سویه ATCC تعلق داشت. سویه MSU در تمامی اندام‌ها بیشترین تعداد ریشه (حداکثر ۷ عدد در هر ریز نمونه) را القا نمود. با این حال، بیشترین وزن خشک ریشه‌های مویین (۰.۲۲ گرم) در ریزنمونه برگ و در هر سه سویهMSU ، A4 و A13 به دست آمد. ریشه‌های مویین حاصل از برگ در تمامی سویه‌ها بالاترین فعالیت آنتی‌اکسیدانی (٪64/08 مهار) و ریشه‌های مشتق‌شده از ریزنمونه ریشه کمترین فعالیت (٪36/21) را نشان دادند. حضور باند اختصاصی ۷۸۰ جفت بازی ژن rolB در محصولPCR ، تراریختی موفق تمامی ریشه‌های مورد مطالعه را تأیید کرد.
نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که انتخاب بهینه‌ی ترکیب ریزنمونه و سویه باکتری، عاملی تعیین‌کننده در موفقیت تراریختی و تولید ریشه‌های مویین در سنبل‌الطیب است. سویه MSU به عنوان کارآمدترین سویه از نظر درصد القا، سرعت تشکیل و تعداد ریشه شناخته شد، در حالی که ریزنمونه برگ برای دستیابی به حداکثر زیست‌توده و فعالیت آنتی‌اکسیدانی برتر بود. این مطالعه گامی مؤثر در جهت استانداردسازی پروتکل تولید ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب به عنوان جایگزینی پایدار و مقرون‌به‌صرفه برای استخراج ترکیبات دارویی این گیاه ارزشمند است.
.
کلیدواژه‌ها

Bandyopadhyay, M., Jha, S., & Tepfer, D. (2007). Changes in morphological phenotypes and withanolide composition of Ri-transformed roots of Withania somnifera. Plant Cell Reports, 26 (5), 599–609. https://doi.org/10.1007/s00299-006-0260-0
Banihashemi, O., Khavari-Nejad, R. A., Yassa, N., & Najafi, F. (2015). Induction of hairy root in Atropa komarovii using Agrobacterium rhizogenes ATCC15834. Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences, 5 (4), 22–31.
Bhat, B., & Sharma, V. D. (2015). In vitro propagation of the Garden Heliotrope, Valeriana officinalis L.: Influence of pre chilling and light on seed germination. Plant Biology, 17 (2), 211–216. https://doi.org/10.1111/plb.12236
Choi, M., Yoon, J., Yang, S. H., Kim, J. K., & Park, S. U. (2023). Production of phenolic compounds and antioxidant activity in hairy root cultures of Salvia plebeia. Plants, 12 (22), 3840. https://doi.org/10.3390/plants12223840
Dasari, R., Gopu, C., Vankudoth, S., Dharavath, S., & Taduri, S. (2020). Enhancement of production of pharmaceutically important anti-cancerous compound; cucurbitacin E via elicitation and precursor feeding of in vitro culture of Citrullus colocynthis (L.) Schard. Vegetos, 33 (2), 323–334. https://doi.org/10.1007/s42535-020-00110-z
Dehghan E, Häkkinen ST, Oksman-Caldentey KM, Ahmadi FS. (2012) .Production of tropane alkaloids in diploid and tetraploid plants and in vitro hairy root cultures of Egyptian henbane (Hyoscyamus muticus L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 110(1): 35-44.
Desmet, S., Dhooghe, E., De Keyser, E., Van Huylenbroeck, J., Müller, R., Geelen, D., & Lütken, H. (2020). Rhizogenic agrobacteria as an innovative tool for plant breeding: Current achievements and limitations. Applied Microbiology and Biotechnology, 104 (6), 2435–2451. https://doi.org/10.1007/s00253-020-10350-3
Dhakulkar, S., Ganapathi, T. R., Bhargava, S., & Bapat, V. A. (2005). Induction of hairy roots in Gmelina arborea Roxb. and production of verbascoside in hairy roots. Plant Science, 169 (5), 812–818. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2005.05.014
El-Esawi, M. A., Elkelish, A., Elansary, H. O., Ali, H. M., Elshikh, M., Witczak, J., & Ahmad, M. (2017). Genetic transformation and hairy root induction enhance the antioxidant potential of Lactuca serriola L. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2017, Article 2494721. https://doi.org/10.1155/2017/2494721
Farhadi, N., & Moghaddam, M. (2024). Application of Recent Advanced Technologies for the Improvement of Medicinal and Aromatic Plants. In A.K. Hvoslef-Eide & W. Preil (Eds.), Liquid culture systems for in vitro plant propagation (pp. 539–546). Springer.
Fitzgerald, J. A., Könemann, S., Krümpelmann, L., Županič, A., & Vom Berg, C. (2020). Approaches to test the neurotoxicity of environmental contaminants in the zebrafish model: From behavior to molecular mechanisms. Environmental Toxicology and Chemistry, 40 (4), 989–1006. https://doi.org/10.1002/etc.4959
Folgado, A., Serra, A. T., Prazeres, I., Bento-Silva, A., Bronze, M. R., & Abranches, R. (2021). Hairy root cultures of Cynara cardunculus L. as a valuable source of hydroxycinnamic acid compounds. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 146 (2), 245–256. https://doi.org/10.1007/s11240-021-02063-w
Ghadermazi, S., Masoud Tohidfar, M. and Miri, S.M. (2016). The Production of Hairy Roots from (Datura innoxia L.) by Agrobacterium rhizogenes and Effects of Salicylic Acid and Methyl Jasmonate Biological Elicitors on Atropine and Scopolamine Content. Journal of Medicinal Plants, 16(10): 141-156. (In Persian)
Ganjali, A., Zare Hassanabadi, M., Elhoti, M., and Moshtaghqi, N. (2019). Evaluation of different strains of Agrobacterium rhizogenes in inducing hairy roots and producing secondary metabolites in basil (Ocimum basilicum L.). Journal of Horticultural Sciences 34 (2), 273-284.
Georgiev, M. I., Pavlov, A. I., & Bley, T. (2007). Hairy root type plant in vitro systems as sources of bioactive substances. Applied Microbiology and Biotechnology, 74 (6), 1175–1185. https://doi.org/10.1007/s00253-007-0856-5
Jadid, N., Ramadani, M. R. N., Widodo, A. F., Sa’adah, N. N., Ermavitalini, D., Rahmawati, M., Sari, S. A., Soleha, I. D., & Mas’ud, F. (2024b). In silico characterization of GbPAL, GbCHS, GbDFR and GbANS structural genes involved in the biosynthesis of flavonoids in Gynura bicolor DC. South African Journal of Botany, 165, 428–442. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2024.01.011
Jadid, N., Soleha, I. D., Rahayu, A. E., Puspaningtyas, I., Sari, S. A., Rahmawati, M., & Hidayati, D. (2024). Exogenous methyl jasmonate (MeJA) altered phytochemical composition and enhanced the expression of PatAACT gene of in vitro culture-derived patchouli var. Sidikalang (Pogostemon cablin Benth.). Journal of King Saud University - Science, 103301. https://doi.org/10.1016/j.jksus.2024.103301
Kaur, G., Prakash, P., Srivastava, R., & Verma, P. C. (2021). Enhanced secondary metabolite production in hairy root cultures through biotic and abiotic elicitors. In T. S. (Ed.), Plant Cell Tissue Differentiation and Secondary Metabolites: Fundamentals and Applications (pp. 625–660). Springer. https://doi.org/10.1007/978-3-030-30185-9_25
Kumar, V., Murthy, K. N. C., Bhamid, S., Sudha, C. G., & Ravishankar, G. A. (2005). Genetically modified hairy roots of Withania somnifera Dunal: A potent source of rejuvenating principles. Rejuvenation Research, 8 (1), 37–45. https://doi.org/10.1089/rej.2005.8.37
Lee S.U., Kimi S.U., Song W.S., Kim Y.K., Park N.I., and Park S.U. (2010). Influence of different strains of 282 Agrobacterium rhizogenes on hairy root induction and production of alizarin and purpurin in Rubiaakane Nakai. Romanian Biotechnological Letters 15(4): 5405-5409.
Marchev, A. S., Yordanova, Z. P., & Georgiev, M. I. (2024). Green (cell) factories for advanced production of plant secondary metabolites. Arabian Journal of Chemistry, 17 (9), 105904. https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2024.105904
Mirazayi Delbari, E., Vatandoust, J., Jami Moeini, M., & Kuhban Bagheirkhira, E. (2022). The effect of Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction in different explants of alfalfa. The Quarterly Scientific Journal of Applied Biology, 35 (3), 127–142.
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15 (3), 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x
Phuong, T. D., Le Thi Mong, V., & Phuong, Q. N. D. (2021). Antioxidant, anti-bacterial activity of Perilla frutescens ethanol extract and induction of hairy roots by Agrobacterium rhizogenes. VNUHCM Journal of Natural Sciences, 5 (1), 975–983. https://doi.org/10.32508/stdjns.v5i1.917
Pirian, K., Piri, K. H., & Ghiyasvand, T. (2012). Hairy roots induction from Portulaca oleracea using Agrobacterium rhizogenes to Noradrenaline’s production. International Research Journal of Applied and Basic Sciences, 3 (3), 642–649.
Saha, K., Lajis, N. H., Israf, D. A., Hamzah, A. S., Khozirah, S., Khamis, S., & Syahida, A. (2004). Evaluation of antioxidant and nitric oxide inhibitory activities of selected Malaysian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, 92(2-3), 263-267
Sathasivam, R., Choi, M., Radhakrishnan, R., Kwon, H., Yoon, J., Yang, S. H., Kim, J. K., Chung, Y. S., & Park, S. U. (2022). Effects of various Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and analyses of primary and secondary metabolites in Ocimum basilicum. Frontiers in Plant Science, 13, 983776. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.983776
Sezen Karaoğlan, E. (2022). Valeriana officinalis L. In Novel Drug Targets With Traditional Herbal Medicines: Scientific and Clinical Evidence (pp. 565–568). Springer.
Soleimani, T., Keyhanfar, M., Piri, K. H., & Hasanloo, T. (2012). Hairy root induction in Burdock (Arctium lappa L.). Journal of Medicinal Plants, 11 (44), 73–83. http://dorl.net/dor/20.1001.1.2717204.2012.11.44.17.9
Srivastava, S., Conlan, X. A., Adholeya, A., & Cahill, D. M. (2016). Elite hairy roots of Ocimum basilicum as a new source of rosmarinic acid and antioxidants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 125 (1), 107–119. https://doi.org/10.1007/s11240-015-0933-x
Srivastava, S., & Srivastava, A. K. (2016). Effect of elicitors and precursors on azadirachtin production in hairy root culture of Azadirachta indica. Applied Biochemistry and Biotechnology, 172 (5), 2286–2297. https://doi.org/10.1007/s12010-013-0664-6
Su, Y., Lin, C., Zhang, J., Hu, B., Wang, J., Li, J., Wang, S., Liu, R., Li, X., Song, Z., & Wang, J. (2022). One-step regeneration of hairy roots to induce high tanshinone plants in Salvia miltiorrhiza. Frontiers in Plant Science, 13. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.913985
Sujatha, G., Zdravković-Korać, S., Ćalić, D., Flamini, G., & Kumari, B. R. (2013). High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Artemisia vulgaris: Hairy root production and essential oil analysis. Industrial Crops and Products, 44, 643–652. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2012.09.007
Tavassoli, P., & Afshar, A. S. (2018). Influence of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and analysis of phenolic and flavonoid compounds in marshmallow (Althaea officinalis L.). 3 Biotech, 8 (8), 351. https://doi.org/10.1007/s13205-018-1375-z
Tiwari, R. K., Trivedi, M., Guang, Z. C., Guo, G. Q., & Zheng, G. C. (2007). Genetic transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes: Growth and production of secoiridoid glucoside gentiopicroside in transformed hairy root cultures. Plant Cell Reports, 26 (2), 199–210. https://doi.org/10.1007/s00299-006-0236-0
Vanek, T., Langhansova, L., & Marsik, P. (2005). Cultivation of root cultures of Panax ginseng in different bioreactors and in temporary immersion Comparison of growth and saponin production. In A.K. Hvoslef-Eide & W. Preil (Eds.), Liquid culture systems for in vitro plant propagation (pp. 539-546). Springer.
Vyas, P., & Mukhopadhyay, K. (2014). Development of a rapid and high frequency Agrobacterium rhizogenes mediated transformation protocol for Ocimum tenuiflorum. Biologia, 69 (6), 765–770. https://doi.org/10.2478/s11756-014-0375-7
Zare Hasan Abadi, M., Ganjeali, M., Lahouti, M., & Moshtaghi, N. (2020). Influence of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy roots induction and secondary metabolites production in Ocimum basilicum L. Journal of Horticultural Science, 34 (2), 273–284. https://doi.org/10.22067/jhorts4.v34i2.82167
Zehra M., Banerjee S., Sharma S., and Kumar S. 1999. Influence of Agrobacterium rhizogenes strains on biomass and alkaloid productivity in hairy root lines of Hyoscyamus muticus and H. albus. Planta Medica 64: 60–63.
Zhao, S., & Tang, H. (2020). Enhanced production of valtrate in hairy root cultures of Valeriana jatamansi Jones by methyl jasmonate, jasmonic acid and salicylic acid elicitors. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 48 (2), 839–848. https://doi.org/10.15835/nbha48211872