مجله پژوهش در متابولیت‌های  گیاهی

مجله پژوهش در متابولیت‌های گیاهی

بهبود تولید محتوای نسبی ترکیبات ترپنی از طریق بهینه‌سازی شرایط القای ریشه موئین در گیاه دارویی سنبل الطیب (Valeriana officinalis L.)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان
1 گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران
2 دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی
3 گروه تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران
10.22034/jrpsm.2026.577954.1109
چکیده
سابقه و هدف: سنبل‌الطیب (Valeriana officinalis L.) از مهم‌ترین گیاهان دارویی و منبع ارزشمند ترکیبات ترپنی است. به‌دلیل محدودیت تولید مزرعه‌ای و کاهش ذخایر طبیعی، استفاده از ریشه‌های موئین القاشده توسط Agrobacterium rhizogenes مورد توجه قرار گرفته است. این پژوهش با هدف بهینه‌سازی شرایط القای ریشه موئین و بررسی اثر آن بر شاخص‌های رشدی و میزان ترپن انجام شد.
مواد و روش­ها: این پژوهش به‌صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. تیمارها شامل چهار سطح استوسیرینگون (0، 100، 150 و 200 میلی‌گرم در لیتر)، دو سطح تراکم سوسپانسیون اگروباکتریوم رایزوژنز (Agrobacterium rhizogenes) سویه MSU440 بر اساس چگالی نوری (OD₆₀₀) 5/0 و 1و سه زمان هم‌کشتی (24، 48 و 72 ساعت) بودند. ریزنمونه‌های برگ سنبل‌الطیب درون‌شیشه‌ای به مدت 10 دقیقه در سوسپانسیون باکتری حاوی استوسیرینگون غوطه‌ور شدند و سپس در محیط کشتMS ، در شرایط تاریکی و دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد، تحت هم‌کشتی قرار گرفتند. پس از پایان هم‌کشتی، ریزنمونه‌ها برای حذف باکتری به محیط کشت حاوی سفوتاکسیم منتقل شدند. تایید تراریختی ریشه‌های موئین با استخراج DNA ژنومی و تکثیر ژن rolB به روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و برنامه دمایی استاندارد انجام شد. صفات اندازه‌گیری‌شده شامل درصد و سرعت القای ریشه موئین، تعداد ریشه در هر ریزنمونه، وزن خشک ریشه و میزان ترپن کل بود. مقدار ترپن با روش رنگ‌سنجی وانیلین–اسید سولفوریک و قرائت جذب در طول موج 550 نانومتر اندازه‌گیری شد. منحنی استاندارد با استفاده از-β کاریوفیلن تهیه و نتایج بر حسب میلی‌گرم معادل-β کاریوفیلن در گرم وزن خشک بیان شد. داده‌ها با نرم‌افزار SAS تجزیه و مقایسه میانگین‌ها با آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت.
یافته­ها: نتایج نشان داد که بیشترین درصد القای ریشه موئین (78 درصد)، بیشترین سرعت القا (9 روز)، بیشترین تعداد ریشه (16 ریشه در هر ریزنمونه) و بالاترین وزن خشک ریشه (64 میلی‌گرم) در تیمار 100 میلی‌گرم در لیتر استوسیرینگون، تراکم باکتری 5/0 OD₆₀₀=و زمان هم‌کشتی 48 ساعت به دست آمد. افزایش غلظت استوسیرینگون به 200 میلی‌گرم در لیتر موجب کاهش معنی‌دار تمامی شاخص‌های رشدی شد که احتمالاً ناشی از تنش اکسیداتیو و اثرات بازدارنده آن بر تقسیم و رشد سلولی بود. همچنین، افزایش تراکم باکتری به 1OD₆₀₀= درصد القا، تعداد ریشه و وزن خشک را کاهش داد که می‌تواند به رشد بیش از حد باکتری، رقابت برای مواد غذایی و تحریک پاسخ‌های دفاعی گیاه نسبت داده شود. زمان هم‌کشتی 48 ساعت نیز به‌عنوان مناسب‌ترین مدت‌زمان شناسایی شد، زیرا هم‌کشتی کوتاه‌تر فرصت کافی برای انتقال مؤثر T-DNA فراهم نکرد و هم‌کشتی طولانی‌تر موجب نکروز بافت و کاهش زنده‌مانی ریزنمونه‌ها شد. بیشترین مقدار ترپن (151/0 میلی‌گرم معادل -βکاریوفیلن در گرم وزن خشک) در تیمار بهینه و کمترین مقدار (036/0 میلی‌گرم در گرم وزن خشک) در تیمار 200 میلی‌گرم در لیتر استوسیرینگون مشاهده شد. همچنین، حضور باند اختصاصی 780 جفت‌بازی ژن rolB در آزمون PCR، تراریختی موفق تمامی ریشه‌های موئین بررسی‌شده را تأیید کرد.
نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که بهینه‌سازی هم‌زمان غلظت استوسیرینگون، تراکم باکتری و زمان هم‌کشتی، کارایی القای ریشه موئین و تجمع ترپن را در سنبل‌الطیب به‌طور معنی‌داری افزایش داد. تیمار 100 میلی‌گرم در لیتر استوسیرینگون، 5/0OD₆₀₀= و 48 ساعت هم‌کشتی، به‌عنوان شرایط بهینه برای تولید ریشه موئین و ترکیبات ترپنی معرفی شد.
کلیدواژه‌ها

Alpizar, E., Dechamp, E., Lapeyre-Montes, F., Guilhaumon, C., Bertrand, B., Jourdan, C., Lashermes, P., & Etienne, H. (2008). Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of coffee (Coffea arabica): Conditions for long-term proliferation, and morphological and molecular characterization. Annals of Botany, 101(7), 929–940. https://doi.org/10.1093/aob/mcn027
Al-Qurainy, F., Nadeem, M., Khan, S., Alansi, S., Tarroum, M., Al-Ameri, A. A., & Gaafar, A. R. Z. (2020). Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains for in-vitro hairy root induction, total phenolic, flavonoids contents, antibacterial and antioxidant activity of (Cucumis anguria L.). Saudi Journal of Biological Sciences, 27(11), 2972–2979. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.08.050
Amini, S., Fattahi, M., & Nazemiyeh, H. (2024). Optimization of induction and hairy root culture establishment in two mullein species, Verbascum erianthum and Verbascum stachydiforme. Scientific Reports, 14, Article 5636. https://doi.org/10.1038/s41598-024-56331-8
Balasubramanian, M., Anbumegala, M., Surendran, R., Arun, M., & Shanmugam, G. (2018). Elite hairy roots of Raphanus sativus (L.) as a source of antioxidants and flavonoids. 3 Biotech, 8(2), Article 128. https://doi.org/10.1007/s13205-018-1153-y
Biglari Farash, R. B., Kheiry, A., Ghahremani, Z., Bagheri, Kh., & Razavi, F. (2026). Study on the efficiency of Agrobacterium strains (Agrobacterium rhizogenes) and different types of explants on the transformation efficiency and antioxidant capacity of hairy roots of valerian (Valeriana officinalis L). Journal of Research in Plant Metabolites, 4 (1), 35. doi:10.22034/jrpsm.2.026.562414.1102
Biswas, D., Chakraborty, A., Mukherjee, S., & Ghosh, B. (2023). Hairy root culture: A potent method for improved secondary metabolite production of Solanaceous plants. Frontiers in Plant Science, 14, Article 1197555. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1197555
Castellanos-Arévalo, A. P., Estrada-Luna, A. A., Cabrera-Ponce, J. L., Valencia-Lozano, E., Herrera-Ubaldo, H., de Folter, S., Blanco-Labra, A., & Délano-Frier, J. P. (2020). Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of grain (Amaranthus hypochondriacus) and leafy (A. hybridus) amaranths. Plant Cell Reports, 39(9), 1143–1160. https://doi.org/10.1007/s00299-020-02553-9
Considine, M. J., & Foyer, C. H. (2021). Oxygen and reactive oxygen species-dependent regulation of plant growth and development. Plant Physiology, 186(1), 79–92. https://doi.org/10.1093/plphys/kiaa077
De Koning, R., Daryanavard, H., Garmyn, J., Kiekens, R., Toili, M. E. M., & Angenon, G. (2023). Fine-tuning CRISPR/Cas9 gene editing in common bean (Phaseolus vulgaris L.) using a hairy root transformation system and in silico prediction models. Frontiers in Plant Science, 14, Article 1233418. doi: 10.3389/fpls.2023.1233418.
Foti, C., & Pavli, O. I. (2020). High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated transgenic hairy root induction of Lens culinaris. Agronomy, 10(8), Article 1170. https://doi.org/10.3390/agronomy10081170
Gelvin, S. B. (2017). Integration of Agrobacterium T-DNA into the plant genome. Annual Review of Genetics, 51, 195–217.https://doi.org/10.1146/annurev-genet-120215-035320
Ghorbani, M., Omidi, M., & Shah Nejat Boushahri, A. A. (2024). Optimization of genetically pRi-transformed roots induction in Dracocephalum kotschyi Boiss. using response surface methodology. Journal of Genetics, 19(3), 159–171. URL: http://mg.genetics.ir/article-1-1804-en.htm
Giri, A., & Narasu, M. L. (2000). Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances, 18(1), 1–22. https://doi.org/10.1016/S0734-9750(99)00016-6
Gutiérrez-Valdes, N., Häkkinen, S. T., Lemasson, C., Guillet, M., Oksman-Caldentey, K. M., Ritala, A., & Cardon, F. (2020). Hairy root cultures—A versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science, 11, Article 33. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.00033
Hussain, M. J., Abbas, Y., Nazli, N., Fatima, S., Drouet, S., Hano, C., & Abbasi, B. H. (2022). Root cultures, a boon for the production of valuable compounds: A comparative review. Plants, 11(3), Article 439. https://doi.org/10.3390/plants11030439
Husain, Z. Z., Warsi, Z. I. I., Khan, S., Mahendran, G., Afroz, S., Chandran, A., Kashyap, P. K., Khatoon, K., Parween, G., Tandon, S., et al. (2024). Metabolic engineering of hairy root cultures in Beta vulgaris for enhanced production of vanillin, 4-hydroxybenzoic acid, and vanillyl alcohol. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 12, 1435190. https://doi.org/10.3389/fbioe.2024.1435190
Liu, L., Qu, J., Wang, C., Liu, M., Zhang, C., Zhang, X., Guo, C., Wu, C., Yang, G., Huang, J., Yan, K., Shu, H., Zheng, C., & Zhang, S. (2024). An efficient genetic transformation system mediated by Rhizobium rhizogenes in fruit trees based on the transgenic hairy root to shoot conversion. Plant Biotechnology Journal, 22(8), 2093–2103. https://doi.org/10.1111/pbi.14328
Park, N. I., Tuan, P. A., Li, X., Kim, Y. K., Yang, T. J., & Park, S. U. (2011). An efficient protocol for genetic transformation of Platycodon grandiflorum with Agrobacterium rhizogenes. Molecular Biology Reports, 38(4), 2307–2313. https://doi.org/10.1007/s11033-010-0363-0
Mahmoudi, M., Sadat-Noori, S. A., Bahmankar, M., Ebrahimi, M., & Fadavi, A. (2025). Shikonin and luteolin production in hairy root culture of Perilla frutescens L. Research Square. https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-7080593/v1
Mahakur, B., Moharana, A., Madkami, S. K., Naik, S. K., & Barik, D. P. (2024). Optimization of factors affecting Agrobacterium-mediated hairy root induction in Vitex negundo L. (Lamiaceae). International Journal of Secondary Metabolite, 11(2), 244–254. https://doi.org/10.21448/ijsm.1368677
Massah, M., & Rabiei, M. (2023). Effect of acetosyringone, sucrose and nutrients on transgenic hairy root induction in Chenopodium quinoa using different Rhizobium rhizogenes strains. Research Square. https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-2833983/v1 
Kim, Y. K., Li, X., Xu, H., Park, N.-I., Uddin, M. R., Pyon, J. Y., & Park, S. U. (2009). Production of phenolic compounds in hairy root culture of tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science and Biotechnology, 12(1), 53–58. https://doi.org/10.1007/s12892-009-0075-y
Kuta, D. D., & Tripathi, L. (2005). Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: A resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology, 4(8), 752–757. https://doi.org/10.4314/ajb.v4i8.15199
Moehninsi, & Navarre, D. A. (2018). Optimization of hairy root induction in Solanum tuberosum. American Journal of Potato Research, 95(6), 650–658. https://doi.org/10.1007/s12230-018-9671-z
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15 (3), 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.
Niazian, M., Belzile, F., Curtin, S. J., de Ronne, M., & Torkamaneh, D. (2023). Optimization of in vitro and ex vitro Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation of soybean for visual screening of transformants using RUBY. Frontiers in Plant Science, 14, 1207762. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1207762
Palmer, A. C. V., & Shaw, C. H. (1992). The role of VirA and VirG phosphorylation in chemotaxis towards acetosyringone by Agrobacterium tumefaciens. Microbiology, 138(12), 2509–2514. https://doi.org/10.1099/00221287-138-12-2509
Piatczak, E., Jeleń, A., & Grzegorczyk-Karolak, I. (2021). Optimization of Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Valeriana officinalis L. and production of valerenic acid in hairy root cultures. Industrial Crops and Products, 168, Article 113589. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2021.113589
Phuong, V. T. B., Anh, N. P., Thang, N. P. Q., Tran, P., & Phuong, Q. N. D. (2023). Study on induction of Allium sativum L. hairy roots with antibacterial activity against Vibrio. Research Journal of Biotechnology, 18(8), 153–162. https://doi.org/10.25303/1808rjbt1530162
Sezen Karaoğlan, E. (2022). Valeriana officinalis L.  in Novel drug targets with traditional herbal medicines: Scientific and clinical evidence, 565-568. Springer. https://doi.org/10.1007/978-3-030-73234-9_39
Sharma, P., Padh, H., & Shrivastava, N. (2017). Optimizing culture conditions for establishment of hairy root culture of Semecarpus anacardium L. 3 Biotech, 7, Article 101. https://doi.org/10.1007/s13205-017-0728-6
Sharma, S., Singh, Y., Verma, P. K., & Vakhlu, J. (2021). Establishment of Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation of Crocus sativus L. 3 Biotech, 11(2), Article 82. https://doi.org/10.1007/s13205-020-02626-2
Singh, P., Labade, D., Chote, M., Deshmukh, P., Panchal, B., Deshpande, J., Phule, A. S., Tabassum, H., & Wani, M. (2025). Efficient regeneration of Stevia rebaudiana Bertoni transformants through hairy root culture technique. Journal of Applied Botany and Food Quality, 98, 22–28. https://doi.org/10.5073/JABFQ.2025.098.003
Sivanandhan, G., Selvaraj, N., Ganapathi, A., & Manickavasagam, M. (2014). An efficient hairy root culture system for Withania somnifera (L.) Dunal. African Journal of Biotechnology, 13(43), 4141–4147. https://doi.org/10.5897/AJB2014.14128
Srivastava, S., & Srivastava, A. K. (2007). Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology, 27(1), 29. https://doi.org/ 10.1080/07388550601173918
Sivakumar, G., Liu, C., Towler, M. J., & Weathers, P. J. (2010). Biomass production of hairy roots of Artemisia annua and Arachis hypogaea in a scaled-up mist bioreactor. Biotechnology and Bioengineering, 107(5), 802–813. https://doi.org/10.1002/bit.22892
Suresh, R., Kamdar, Y., Garg, V., Kalathoti, A., & Renganathan, G. (2021). Evaluation of improved and current vanillin based colorimetric quantification methods of triterpenoids. Journal of Student Research, 10(2). https://doi.org/10.47611/jsrhs.v10i2.1442
Tao, J., Tan, R. F., & Li, L. (2006). Genetic transformation of sunflower (Helianthus Annuus L.) mediated by Agrobacterium rhizogenes. Acta Agronomica Sinica, 32(5), 743–748.
Tiwari, M., Mishra, A. K., & Chakrabarty, D. (2022). Agrobacterium-mediated gene transfer: Recent advancements and layered immunity in plants. Planta, 256(2), Article 37. https://doi.org/10.1007/s00425-022-03951-x
Torkamani, M. R. D., Jafari, M., Abbaspour, N., Heidary, R., & Safaie, N. (2014). Enhanced production of valerenic acid in hairy root culture of Valeriana officinalis by elicitation. Central European Journal of Biology, 9, 853–863. https://doi.org/10.2478/s11535-014-0320-3
Xi, J., Patel, M., Dong, S., Que, Q., & Qu, R. (2018). Acetosyringone treatment duration affects large T-DNA molecule transfer to rice callus. BMC Biotechnology, 18, Article 48. https://doi.org/10.1186/s12896-018-0459-5
Yan, Z., Liu, S., Zhang, J., Huang, G., Duan, L., & Ye, Y. (2020). Optimizing hairy root production from explants of Phyllanthus hainanensis, a shrub used for traditional herbal medicine. Frontiers of Agricultural Science and Engineering, 7(4), 513–522. https://doi.org/10.15302/J-FASE-2019272